摘要：
目的 对肺炎克雷伯菌(KP)中标注的氨基肽酶(PepA)进行序列扩增与蛋白表达,鉴定其酶活特性.方法 根据(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)公布的KP PepA基因序列(Reference Sequence:NZ_CP045783.1)设计扩增引物,以本科室前期分离到的一株KP基因组为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增出PepA基因全长,使用Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后连接至表达载体pET-30a.将重组质粒pET-30a-PepA转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达出KP PepA蛋白,使用N2+层析柱对重组His标签蛋白进行纯化.以亮氨酸-对硝基苯胺(Leu-pNA)为底物,测定KP PepA对其水解能力,并摸索不同的反应温度和pH值条件对水解反应的影响.在反应体系中加入不同二价金属离子,观察各离子对KP PepA氨基肽酶活性的作用.组间比较采用t检验.结果 扩增出长度为1 527 bp的KP PepA基因,并获得可溶性KP PepA蛋白,大小为56.1 × 103,与预测大小一致.KP PepA加入组反应产物pNA浓度显著高于KP PepA不加组[(205.00±5.00)μmol/L 比(8.00±2.00)μmol/L,t=63.36,P＜0.01],表明重组 KP PepA 可以水解Leu-pNA.KP PepA水解Leu-pNA的最适温度为37℃,最适pH值为pH 8.0.Co2+、Mn2+均可以提高KP PepA酶活性,其中Co2+激活作用最强,加入Co2+组的相对酶活性显著高于不加离子组(181.70±7.64 比 95.00±0.00,t=16.44,P＜0.01);Zn2+、Fe2+均可以抑制 KP PepA 酶活性,其中Zn2+抑制作用最强,加入Zn2+组的相对酶活性显著低于不加离子组(44.67±8.97比95.00±0.00,t=8.49,P＜0.01).结论 肺炎克雷伯菌中标注的PepA具有体外氨基肽酶活性.
