摘要：
目的 放射治疗是结直肠癌综合治疗的重要组成部分,尤其是对于中晚期和术前放疗患者,目前结直肠癌对放疗敏感性较差,急需新的增敏靶点.本研究旨在探讨沉默Msi1(Musashi1)通过靶向调节p21对结直肠癌细胞放疗敏感性影响.方法 蛋白质印迹法检测结直肠癌HT29、HCT116细胞及正常肠上皮细胞CCD841中Msi1蛋白表达,选择Msi1高表达的细胞系作为后续研究的靶细胞,将含有2种不同干扰序列慢病毒分别转染该细胞后,用qRT-PCR筛选出沉默效果最好的细胞株作为沉默组.实验中将结肠癌细胞分为空白组(Blank)、阴性对照组(NC)、沉默组1(Msi1-shRNA1)和沉默组2(Msi1-shRNA2).克隆形成实验检测沉默Msi1基因对结直肠癌细胞放射敏感性的影响.MTS法检测6 GyX射线照射后结直肠癌细胞增殖情况,并计算抑制率.流式细胞术检测6 GyX射线照射后细胞凋亡情况.蛋白质印迹法检测沉默Msi1后p21蛋白表达水平,双荧光素酶实验证实Msi1与下游基因p21 3'-UTR相互作用.结果 结直肠癌HT29、HCT116细胞中Msi1蛋白表达水平高于正常肠上皮细胞CCD841,分别为(1.000±0.181)、(1.102±0.219)和(0.106±0.051),符合正态分布,其中HCT116细胞中Msi1蛋白表达量最高(F=32.42,P=0.000 6),因此选择HCT116细胞作为靶细胞进入后续实验.Msi1-shRNA1组的沉默效果优于Msi1-shRNA2组,F=68.37,P＜0.001.克隆形成实验显示,经0～8 Gy X射线照射后,沉默Msi1后HCT116细胞存活曲线下降,相对于空白组和阴性对照组放射增敏比SER分别为1.56和1.47,Blank组与NC组差异无统计学意义,t=2.088,P=0.105 0.MTS实验结果显示,与未照射组相比,给予6 Gy照射后的24、48和72 h,各组细胞的增殖速度降低,并随着时间增加抑制率逐渐增加(F照射=62.16,P＜0.001),Msi1-shRNA1组细胞在各时间点的抑制率均高于另外2组细胞,F时间=71.36,P＜0.001.流式细胞术显示,经过6 Gy照射后Msi1-shRNA1组细胞凋亡率(28.04±5.49)％高于Blank组(13.99±3.21)％和NC组(12.42±2.29)％,F=14.57,P=0.005 0.辐射后各组细胞凋亡比例均增加,但Msi1-shRNA1组增加更加明显,F=8.795,P=0.016 5.Msi1-shRNA1组p21蛋白表达明显高于Blank组和NC组,分别为(1.000±0.175)、(1.040±0.130)和(2.210±0.247),F=39.15,P=0.000 4.双荧光素酶实验证实Msi1 shRNA1组p21 3'UTR野生型的荧光素酶活性显著上升(F=102.5,P＜0.000 1),而3组细胞p21 3'-UTR突变型的荧光素酶活性差异无统计学意义,P＞0.05.结论 沉默结直肠癌Msi1基因,可能通过靶向上调p21,诱导辐射后细胞凋亡,抑制放疗后肿瘤细胞增殖,从而增加放疗敏感性.
