摘要：
目的 探讨中电导钙激活钾离子通道(KCa3.1)抑制剂1-[(2-氯苯基)二苯甲基]-1H-吡唑(TRAM-34)对高磷诱导大鼠胸主动脉平滑肌细胞钙化的作用及其机制.方法 体外培养原代大鼠主动脉平滑肌细胞和胸主动脉环,将传代培养至第4代的细胞和血管环均分为3组:对照组(加入含10％胎牛血清的DMEM培养基)、高磷组(在对照组培养基的基础上,加入10 mmol/L β-甘油磷酸)和TRAM-34干预组(在高磷组培养基的基础上,加入20 nmol/L TRAM-34).采用邻甲酚酞络合酮比色法检测细胞和血管环的钙含量;采用荧光探针法测定胸主动脉平滑肌细胞内的钙离子浓度;采用RT-PCR和Western blot检测各组细胞中调节成骨和软骨分化的Runt相关转录因子2(Runx2)的表达水平;采用免疫组织化学法检测各组胸主动脉环中Runx2的表达水平;采用磷酸苯二钠法测定胸主动脉平滑肌细胞中碱性磷酸酶(ALP)活性.结果 (1)胸主动脉平滑肌细胞体外培养12 d后,高磷组钙含量高于对照组[(121.67 ±6.17) mg/g蛋白比(84.38±8.17) mg/g蛋白,P＜0.05],TRAM-34干预组钙含量[(93.31 ±11.36) mg/g蛋白]低于高磷组(P＜0.05).胸主动脉环体外培养12 d后,高磷组钙含量高于对照组[(7.17 ±0.57) mg/g蛋白比(1.18 ±0.13) mg/g蛋白,P＜0.05],TRAM-34干预组钙含量[(4.71 ±0.42) mg/g蛋白]低于高磷组(P＜0.05).(2)胸主动脉平滑肌细胞体外培养4d后,高磷组细胞内的钙离子浓度高于对照组(349.22±40.47比151.67±16.94,P＜0.05),TRAM-34干预组细胞内的钙离子浓度(194.67±22.21)低于高磷组(P＜0.05).(3)胸主动脉平滑肌细胞体外培养4d后,RT-PCR结果显示,高磷组细胞Runx2 mRNA表达水平高于对照组(0.630±0.033比0.340 ±0.058,P＜0.05),TRAM-34干预组细胞Runx2 mRNA表达水平(0.399±0.023)低于高磷组(P＜0.05);Western blot结果显示,高磷组细胞Runx2蛋白表达水平高于对照组(0.865±0.031比0.414±0.011,P＜0.05),TRAM-34干预组细胞Runx2蛋白表达水平(0.575 ±0.014)低于高磷组(P＜0.05).胸主动脉环体外培养4d后,免疫组织化学结果显示,高磷组的Runx2表达水平高于对照组(0.113±0.010比0.067±0.008,P＜0.05),TRAM-34干预组的Runx2表达水平(0.069 ±0.006)低于高磷组(P＜0.05).(4)胸主动脉平滑肌细胞培养12 d后,高磷组ALP活性高于对照组[(96.56±9.84) U/g蛋白比(46.92±4.60) U/g蛋白,P＜0.05],TRAM-34干预组ALP活性[(70.20±8.41) U/g蛋白]低于高磷组(P＜0.05).结论 KCa3.1抑制剂TRAM-34抑制高磷诱导大鼠胸主动脉平滑肌细胞钙化,可能是通过抑制平滑肌细胞钙离子内流,降低Runx2的表达水平,抑制平滑肌细胞向成骨或成软骨细胞表型转化来实现.
